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细胞克隆形成实验技术服务|实验技术服务——pczn1质粒+arctic express宿主菌低温表达体系。

我们具备丰富的蛋白表达设计经验及实验操作技巧，承诺客户不成功不收费。我们所有的实验数据真实可信，我们提供原始的表达菌株和克隆质粒，客户可以依据我们的实验报告重复我们的实验结果。

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测序实验流程：

概念：

细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

1．试剂与材料

(1)供融合用的脾细胞及瘤细胞。

(2)1640培养液100ml。

(3)完全1640液100ml。

(4)2.5%fcs－1640液50ml。

(5)hat培养液100ml。

(6)50%peg：取分子量4000，高纯度的（日本进口或serva）peg10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（w/v）混合，以红检查ph，一般不必调ph。如ph有改变，可用hcl或nahco3调整。

(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

(8)40孔塑料培养盘。

2．操作方法

⑴准备好脾细胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠瘤细胞，并加入50ml2.5%fcs－1640液。

⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。

⑹加预热至40℃的50%peg0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。

⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。

⑻重复⑺一次。

⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。

⑽重复⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。

⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有hat的完全1640液。

⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。

⒂轻摇后，放入5%co2饱和湿度的37℃温箱中培育。

⒃第3、6、9、10日换入含hat的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。

⒄于第12、15日加入含有hat的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。

⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消hat液和完全1640液而代之以10%fcs－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。

注意事项：

1、虽然本试剂盒过期后很久还有使用价值但还是请您在有效期内使用。

2、在检测腹水类单抗时要稀释到1/5万，虽然可以分辨但并不建议您这样做。此类样品成分十分复杂，有干扰结果的可能。在此种情况下您可以选择本公司的c030215抗体鉴定试剂。它会给您带来满意的结果。

3、手洗板子时一定要把孔加满，停留10秒然后弃尽，后要拍干净。特别是在酶标二抗温育后洗板时一定要把酶吸出而不是甩出，要吸净。这个在手工洗板时对结果很重要。

4、一次没用完的板子要带干燥剂放自封袋封好，随盒存放。

5、拿放板子时不要剧烈抖动，以免孔间交叉污染出现错误结果。

6、出现异常结果请随时咨询我们。